Los antígenos presentes en los tejidos y líquidos biológicos se pueden detectar y cuantificar mediante muchas técnicas inmunológicas basadas en la extraordinaria especificidad de las reacciones antígeno-anticuerpo.
REACCIONES DE PRECIPITACIÓN:
Uno de los primeros descubrimientos acerca de la reacción antígeno-anticuerpo fue su capacidad para dar lugar a precipitados cuando se combinan en proporciones iguales o próximas al punto de equivalencia.
Cuando estas reacciones se llevan a cabo en geles de agarosa es posible probar diversos antígenos en una sola muestra de suero.
Tipos:
Inmunodifusión en gel: se enfrentan antígenos y anticuerpos colocándolos en hoyos o pozos circulares adyacentes hechos en la agarosa, para que se formen líneas de precipitación entre ellos.
Inmunoelectroforesis: Algunas mezclas de antígenos son muy complejas como para ser analizadas por difusión y precipitación simples, por lo que fue necesario desarrollar este método, que consiste en separar los antígenos según su carga eléctrica y visualizarlos después por precipitación.
Estas técnicas sólo permiten analizar los antígenos y los anticuerpos de forma cualitativa, pero mediante una modificación posterior se desarrolló la técnica de:
Inmunodifusión radial: Para cuantificar se incorpora al gel cierta cantidad de de los anticuerpos correspondientes, con lo que al aplicar la muestra al hoyo y dejarla difundir libremente, se forma un precipitado circular, en forma radial.
El diámetro del círculo del precipitado guarda proporción con la cantidad de antígeno en la muestra. De esta forma, se puede establecer una curva de referencia o calibración con cantidades conocidas del antígeno e interpolar los valores de las muestras desconocidas.
TÉCNICAS DE AGLUTINACIÓN:
Son útiles para la detección de antígenos y anticuerpos. Su fundamento es inducir una agrupación microscópicamente visible de partículas, causada por interacciones antígeno anticuerpo que forman puentes entre ellas.
Usualmente el antígeno se encuentra en las partículas y los anticuerpos forman puentes. Existen varios tipos de aglutinación en donde se destacan:
- Aglutinación activa: anticuerpos dirigidos contra componentes de las partículas (eritrocitos, bacterias). Un ejemplo de este caso es la determinación de grupos sanguíneos.
- Aglutinación pasiva: los anticuerpos se dirigen contra moléculas que se han adherido intencionalmente a una partícula que actúa como medio de soporte pasivo (látex). Una variante es la aglutinación pasiva reversa, en donde lo que se detecta es el antígeno y las partículas están recubiertas por el anticuerpo.
MÉTODOS INMUNOENZIMÁTICOS:
Las técnicas inmunoenzimáticas dieron sus primeros pasos a mediados de los años 60 al ser utilizadas en técnicas de inmunofluorescencia, poco después la observación de que tanto antígenos como anticuerpos pueden ser unidos a una fase sólida, permitió el desarrollo de estos métodos para la detección y cuantificación de estas biomoléculas.
Como indican su nombre, se basan en el marcaje de anticuerpos o antígenos con enzimas, para su posterior detección.
La técnica más conocida y utilizada es el Enzime –linked inmunosorbent assay (ELISA) debido a su mayor versatilidad y simplicidad. Puede utilizarse para la cuantificación de antígenos o de anticuerpos:
Cuantificación de antígeno:
Se une a una fase sólida (placa plástica con hoyos, placa de 96 hoyos) una capa de anticuerpos que capturan el antígeno presente en las muestras. Se agrega la muestra y se tiene un período de incubación para que el antígeno se una al anticuerpo. Se lava para eliminar las moléculas no unidas.
El complejo anticuerpo-antígeno formado se detecta mediante una segunda capa de anticuerpos contra el antígeno los cuales están conjugados con una enzima indicadora. Posterior a este paso, se agrega el sustrato de la enzima que genera una reacción de color que es leída por un espectrofotómetro.
Cuantificación de anticuerpo:
El antígeno está unido a la fase sólida, el cual es reconocido por el anticuerpo de la muestra. El complejo formado es detectado mediante un anti-anticuerpo marcado con la enzima.
INMUNOELECTROTRANSFERENCIA: WESTERN BLOT
Combina una separación electroforética de los antígenos, su transferencia electroforética a un medio de soporte en forma de membrana u hoja, y finalmente su inmunodetección a través del uso de anticuerpos marcados.
